【摘要】
研究背景:子宫自然杀伤（uNK）细胞是目前围着床期子宫内膜的主要白细胞。以往研究发现，与生育能力正常的女性相比，uNK细胞存在比率在反复生育失败的女性中存在争议。目的:比较uNK细胞百分比在反复生育失败和生育能力正常女性中的不同。设计：这是在大学附属医院进行的一项回顾性研究。共有来自3所大学研究中心的215名女性参与，其中包括97名复发性流产（RM）的女性、34名反复种植失败（RIF）的女性和84名生育能力正常的女性。在自然排卵周期黄体生成素激增（LH峰）后7天进行子宫内膜活检。子宫内膜切片标准化流程进行CD56免疫组化染色和细胞计数。结果由染色阳性的uNK细胞/基质细胞百分比表示。结果:自然周期排卵正常的中国妇女uNK细胞百分比中位数为2.5%(0.9~5.3%)。使用5th为下限和95th为上限，确定uNK细胞百分比参考范围是1.2-4.5%。总体来说，RM组子宫自然杀伤细胞百分比明显高于正常对照组（RM：中位数为3.2%（0.6-8.8 %）；RIF：中位数为3.1%（0.8-8.3 %））。然而，这两组中有一部分(RM组中16/97；RIF组中6/34)的uNK细胞百分比低于正常对照组。结论：在这项研究中，建立了可生育女性uNK细胞百分比的参考范围。反复生育失败女性uNK细胞百分比高于或低于参考范围。
关键词：可生育女性，反复种植失败，复发性流产，参考范围，子宫自然杀伤细胞
子宫自然杀伤（uNK）细胞是目前在子宫内膜的主要白细胞，这些子宫内膜颗粒细胞的表型是CD56+ CD16-, 而在外周血中CD56- CD16+自然杀伤（NK）细胞为主要亚群。 CD56+ NK细胞数量随着整个月经周期变化，分泌中期也就是LH峰6-7天后有一个激增，这个时期通常被认为是胚胎种植的开始。研究显示反复种植失败的女性围种植窗期子宫内膜的uNK细胞比率是不同的。应用免疫组化研究显示，CD56+NK细胞在复发性流产和IVF反复种植失败患者的围着窗期子宫内膜中表达升高。然而，在反复性流产女性中uNK细胞测量对预后价值尚未得到证实。此外，尽管在可生育女性uNK细胞正常参考范围尚未确立，但由于种植失败寻求uNK细胞检测的妇女呈增长趋势。本研究的目的是采用最近公布的方法学、精确的子宫内膜活检时间（LH+7），来确定uNK细胞百分比参考值范围，并和反复生育失败的女性相比较。
一、 材料与方法
研究对象来自三个医疗中心的患者，如表1：
PWH为中国人，正常生育女性23人，复发性流产97人，反复种植失败34人；SZH为中国人，包括正常生育女性49例；STH为白种人，包括可生育女性12人。
在这项研究中，所有受试者每日尿试纸测试，从月经周期9天起确定的LH峰（排卵），时间精确到LH峰后7天，也就是围着床期子宫内膜活检日，所有活检使用Pipelle采样得到。一抗采用鼠抗人单克隆抗体的主要抗-CD56 (NCL-CD56-504; Novocastra Laboratories, Newcastle, United Kingdom)进行免疫组化CD56染色。细胞计数的方法采用根据约定和标准化协议的一项多中心工作组制定的方法，旨在减少结果之间的差异 。uNK细胞数（CD56 +染色）和间质细胞（CD56-染色）使用人工图像检测，结果表示为总基质细胞的百分比。 （图1）
统计学分析采用Shapiro Wilk检验，所有结果均为正态分布数据，用均数±标准差或者中位数表示。CD56+细胞比例5%-95%结果表示生育的下限和上限，作为参考范围。非参数（Mann Whitney U）试验是用来比较女性CD56+细胞的百分比。
二、 结果
1. 入组患者
所有参与者都有规律的月经周期；在正常可生育组，中国育龄妇女的平均年龄为29岁（22-38），白人女性的平均年龄为36岁（30-42，）；可生育组没有一次自发性流产史 ；在复发性流产组，流产次数平均为3（3-5），平均年龄为35岁（26-40）；在反复种植失败组，失败的IVF周期平均为4（3-6），平均年龄为37岁（32-40）。
2. uNK细胞在可生育女性中的百分比
所有入组女性均有自然排卵的月经周期，本研究使用5th- 95th的可信区间作为可生育女性围着床期子宫内膜uNK细胞的正常范围，72例中国可生育女性uNK细胞均数的百分比为2.5%（0.9-5.3 %），12例白种妇女uNK细胞均数的百分比为3.3%（1.1-5.3 %）。中国人和白种人之间没有显着差异。
3. uNK细胞在反复生育失败女性中的百分比
uNK细胞百分比均数在复发性流产组的妇女为3.2%（0.6-8.8 %），并在反复种植失败的女性为3.1%（0.8-8.3 %） ；相比于正常人的平均水平（2.5%），在复发性流产组的百分比是升高的（P = 0.42），反复种植失败也是升高的（P = 0.48） 。
4. uNK细胞在反复种植失败女性中的百分比
使用5th （1.2%）为下限和95th （4.5%）为上限，定义uNK细胞百分比参考范围：复发性流产的妇女60/97（62%）在参考范围内，21位女性高于上限，16位女性在低于下限 ；反复种植失败的妇女18/34（53%）在参考范围内，10位女性高于上限，6位女性低于下限。
三、讨论
在这项研究中，我们建立了中国可生育女性围着窗期子宫内膜uNK细胞百分比5th - 95th 的可信区间参考范围，我们也观察到，反复种植失败的女性uNK细胞百分比升高，同时有62%的复发性流产的患者和53%种植失败的患者在此参考范围之内。
1. uNK细胞的检测方法
缺乏对NK细胞的百分比测量的标准方法，是了解这些细胞在妊娠中的作用中的障碍 ，然而一个工作组最近发布的方法，解决了这一问题。采用标准化方法定时采样、处理标本以及计算。在本次实验中，我们采用了这一新方法，应用分析显示可接受的变异水平。在目前的研究中，对自然杀伤细胞的测量结果表示为一个百分比（CD56 + /基质细胞数）而不是uNK细胞每视野的绝对数量，在uNK细胞测量标准化建议中也是推荐用uNK细胞百分比表示。考虑到子宫内膜在种植窗期，内膜的形态和功能以及uNK细胞数量随着月经周期变化迅速，所以内膜活检的时间精确是十分重要的。本次实验，所有妇女活检进行精确定时在LH峰7日后。
2. uNK细胞的参考范围
尽管许多关于自然杀伤细胞的数量的文章报道，但都缺乏来自可生育女性的足够数据，我们的研究表明，在自然排卵周期可生育中国女性围种植窗期子宫内膜uNK细胞百分比参考值范围可定义为1.2% - 4.5%，然而，这些发现可能不适用于控制性卵巢周期或冷冻胚胎移植周期。据我们所知，在我们的研究中，中国可生育女性数量设计（N = 72）是目前已发表的最大群体，在这项研究中，我们选择使用 5th-95th确定参考范围，4.5% uNK细胞的上限与Quenby等人报道相似。据我们所知，除了我们的研究，以往的研究都将焦点集中在参考范围的上限，对下限的忽视对生育是不利的。基于我们提出的参考范围，我们定义了一个下限1.2%，发现约有16%（16 / 97）复发性流产的妇女和18%左右（6 / 34）反复植入失败妇女uNK细胞百分比低于此值，这种结果与临床相关性需要进一步调整。
3. uNK细胞和复发性流产及反复种植失败
一些研究表明，uNK细胞百分比在复发性流产的育龄妇女和正常可生育女性之间无显著性差异，而绝大多数的研究发现复发性流产女性中的uNK细胞百分比是增高的。这项研究中，这是与许多早期的研究结果一致，表明uNK细胞百分比均数在反复流产的妇女中增加 ，约22%（21 / 97）的复发性流产的女性有较高uNK百分比，高于我们界定的上限。早期的研究发现，在反复植入失败的年轻女性uNK细胞比例没有增加 ，然而，其他一些研究报告，IVF后反复种植失败子宫内膜uNK细胞百分比增加。在这项研究中，我们还发现uNK细胞在反复植入失败的妇女中显著增加，大约有29%（10/34）妇女uNK细胞百分比高于上限。
4. 种族间的比较
较早的一项研究比较了中国和白种人群的外周NK细胞，发现中国女性外周血NK细胞数量高于白种妇女 ，然而据我们所知，还没有任何研究报告对各种族uNK细胞变化有明确的结论。 在这项研究中，中国人与白种人可生育女性uNK细胞的百分比的中位数和范围是相似的，建立参考值范围可适用于两人群，然而，在这项研究中，白种妇女的数量非常小，需要更大的样本量来证实这一观察结果。
5. 本研究的优势
有几项优势 第一，取标本的时间是精确的；第二，uNK细胞的计数选用的是标准方式；第三，招募了72名可生育中国妇女以建立参考范围，这比以前的研究群体要大得多。
