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这两项研究表明，长久以来流行的抗CTLA-4抗体Ipilimumab在癌症免疫治疗中的免疫检查点假说并不成立，即Ipilimumab并没有通过阻断CTLA-4/B7相互作用而发挥抗肿瘤效果，而清除Fc受体介导的高表达CTLA-4的肿瘤局部调节性T细胞（Treg）则在有效的免疫治疗中至关重要。作者利用CTLA-4人源化的新生小鼠模型，模拟临床上Ipilimumab单用以及联用造成的各个脏器的免疫副作用，并评估了其它抗CTLA-4抗体的安全性，阐明了失调的自身反应性Treg及全身T细胞的活化是造成免疫副作用的根本原因。这些研究成果对今后研发新一代高效并且安全的抗CTLA-4抗体以及其它以CTLA-4为靶点的药物有着深远的指导意义。
近年来，随着肿瘤免疫调控机制的逐渐清晰和基因改造技术的不断提高，肿瘤免疫治疗领域得到了空前发展。尤其是近几年来，免疫检查点 （Immune Checkpoint）单抗药物与嵌合抗原受体T（CAR-T）细胞免疫治疗的效果逐渐获得认可，癌症免疫治疗的概念也越来越深入人心。目前肿瘤免疫药物治疗的最主要方面是肿瘤免疫检查点抑制剂，即通过抑制肿瘤细胞的免疫逃逸，调动自身免疫系统功能来消除肿瘤，当前的研究主要集中在CTLA-4、PD-1和PD-L1三个分子上。
CTLA-4分子高表达于调节性T淋巴细胞（Treg）和激活的T淋巴细胞上。正常情况下，T淋巴细胞的活化需要两条信号通路共同激活，其一是T细胞受体（TCR）与抗原呈递细胞（APC）呈递的MHC-抗原肽复合物相结合（信号1），其二是B7分子（B7-1或B7-2）与T细胞表面的共刺激分子CD28相结合（信号2）。T细胞活化后高表达的CTLA-4分子虽然与CD28具有高度同源性，但功能相反，即CTLA-4分子与B7分子结合后抑制T细胞的活化。
2011年，美国FDA批准首款抗CTLA-4抗体抑制剂Ipilimumab（商品名YERVOY®）用于黑色素瘤的治疗，疗效显著。根据免疫检查点阻断的假说（Checkpoint Blockade Hypothesis），在外周淋巴器官，抗CTLA-4抗体如Ipilimumab是主要通过阻断抑制性的CTLA-4/B7信号通路【图1】，从而促进T细胞的激活而发挥抗肿瘤作用。然而这一流行的关于Ipilimumab在癌症免疫治疗中发挥作用的主要假说并没有得到严格的实验验证。
图1. T细胞的活化需要通过TCR/MHC（信号1）和CD28/B7（信号2）进行共刺激。 抗原呈递细胞（APC）上的B7分子（包括B7-1和B7-2）与T细胞上的CTLA-4的结合抑制T细胞功能。 抗CTLA-4抗体阻断CTLA-4结合B7并阻止其对T细胞功能的抑制。
虽然Ipilimumab可以阻断锚定状态的（Immobilized ）CTLA-4分子和游离的（Soluble ）B7分子的相互作用【图2A】（J Immunol. 2003 Dec 1;171(11):6251-9.），但B7分子是膜表面表达的共刺激分子，因此以前的研究并不能证实Ipilimumab能够有效阻断在生理状态下的CTLA-4和B7的相互作用。刘阳/郑盼教授联合实验室的研究表明，当B7分子被固定后（比如B7包被在ELISA板上时【图2B】或者表达在细胞表面【图2C】），Ipilimumab（包括临床上使用的Ipilimumab以及按照已公布的抗体序列由不同公司合成的Ipilimumab）在体外并不能很好地阻断细胞表面的CTLA-4/B7的相互作用【图2D】，也不能有效地阻断CTLA-4介导的B7分子的转胞吞（Transendocytosis）作用【图2E】。与此不同的是，刘阳/郑盼教授联合实验室筛选出的另外一种抗CTLA-4的半人源化的抗体L3D10 （Blood. 2005 Feb 1;105(3):1114-20.和Blood. 2005 Nov 1;106(9):3127-33.），却能非常显著地阻断各种形式的CTLA-4/B7的体外相互作用【图2】。 此外，在human CTLA-4 knock-in的人源化小鼠和human CD34+ stem cells重组的NSG小鼠中，L3D10——而不是Ipilimumab——能够显著抑制human CTLA-4对脾脏树突状细胞表面B7分子的转胞吞下调【图2F】，从而提供了在体内实验中的生理状态下Ipilimumab不能有效阻断CTLA-4/B7相互作用的证据。
图2. 当B7分子被固定时，L3D10——而不是Ipilimumab——能够在体外和体内显著阻断CTLA-4/B7的相互作用。（摘自Cell Research (2018) doi:10.1038/s41422-018-0011-0）
更重要的是，刘阳/郑盼教授联合实验室的研究指出，阻断CTLA-4/B7的相互作用，并没有贡献于抗CTLA-4抗体的抗肿瘤效果。这一论断来自多个方面的实验证据：
1）在human CTLA-4全人源化（CTLA4h/h，即CTLA4的两个等位基因均来自human）的小鼠模型中，抗human CTLA-4的抗体L3D10能够有效阻断CTLA-4/B7的相互作用；而在human CTLA-4半人源化（CTLA4h/m，即CTLA4的两个等位基因一个来自human，一个来自mouse）的小鼠模型中，只能识别human CTLA-4的L3D10不能有效阻断CTLA-4/B7的相互作用。尽管如此，在CTLA-4全人源化和半人源化的小鼠模型中，L3D10和Ipilimumab都能有效的消除MC38肿瘤【图3A、图3B】和减缓B16肿瘤的生长。
2）将半人源化的L3D10进行完全人源化后筛选得到的两株失去阻断CTLA-4/B7相互作用能力的HL12和HL32抗体【图3C】，并没有影响其抗肿瘤的作用，因为HL12和HL32展现出与Ipilimumab一样的抗肿瘤效果【图3D】。
3）用B7分子的阻断性抗体1G10/GL1处理实验小鼠，在事先阻断B7功能的情况下，Ipilimumab仍能发挥有效的抗肿瘤作用，进一步说明其并不依赖于阻断抑制性的CTLA-4/B7信号通路【图3E】。
4）三种常见的抗mouse CTLA-4抗体（4F10/9D9/9H10），它们阻断CTLA-4/B7相互作用的能力差别很大（如9D9和L3D10一样具强阻断能力，而9H10则不显示或者具备非常弱的阻断能力）。然而，文献报道它们都具备非常好的抗肿瘤作用。
图3. 抗CTLA-4抗体治疗肿瘤的主要分子机制是通过清除肿瘤局部的Treg，而不是通过阻断CTLA-4/B7相互作用的抑制性信号通路。（摘自Cell Research (2018) doi:10.1038/s41422-018-0011-0）
深入研究表明，所有能有效抗肿瘤的抗CTLA-4抗体，包括强阻断能力的L3D10和非常弱阻断能力的Ipilimumab/HL12/HL32，都能够有效的清除肿瘤局部的Treg【图3F，图3G】。而用Fc受体的阻断抗体2.4G2同时处理小鼠来消除抗体介导的细胞杀伤作用（antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC）和抗体介导的细胞吞噬作用（antibody-dependent cellular phagocytosis，ADCP），则能显著逆转Ipilimumab的抗肿瘤效果【图3H】。因此，刘阳/郑盼教授联合实验室的研究表明，抗CTLA-4抗体发挥治疗肿瘤功效的主要分子机制是通过清除肿瘤局部的Treg，而不是通过阻断CTLA-4/B7相互作用的抑制性信号通路。这项研究有力地驳斥了当前流行的在癌症免疫治疗中针对CTLA-4分子的免疫检查点的理论假说。
刘阳/郑盼教授联合实验室在CTLA-4领域的另一个方面的研究，集中在建立和评估抗CTLA-4抗体在免疫治疗诱导的副作用（irAE，immunotherapy related adverse events）的小鼠模型。Ipilimumab作为肿瘤免疫治疗的杰出代表，具有非常好的抗黑色素瘤的作用，同时也有非常强的免疫治疗诱导的副作用（N Engl J Med. 2015 Jul 2;373(1):23-34.）。临床研究表明，针对多靶点的更有效的联合用药是免疫治疗的临床推进方向，例如Ipilimumab和Nivolumab （抗PD-1的抗体）强强联合后抗肿瘤效果大增。然而，一半以上的患者产生了3-4级严重的副作用，因此限制了抗CTLA-4抗体的研发与应用（Lancet Oncol. 2017 Jan;18(1):31-41.和N Engl J Med. 2017 Nov 9;377(19):1824-1835.）。 目前，并没有一个非常好的临床前模型来评估抗CTLA-4抗体的免疫治疗诱导的副作用。
图4. 利用CTLA-4人源化的新生小鼠模型来模拟临床上Ipilimumab单用以及联用造成的免疫副作用，并评估Ipilimumab和其它抗CTLA-4抗体的安全性。（摘自Cell Research (2018)doi:10.1038/s41422-018-0012-z）
研究发现， CTLA-4人源化的新生小鼠模型【图4A】，可以用来有效地模拟临床上Ipilimumab单用以及联用造成的各个脏器的免疫副作用。这些副作用的表型和临床发现的Ipilimumab单独治疗或联合抗PD-1抗体治疗后产生的副作用表型非常相似【图4B】。比如，贫血，心肌炎，肺炎，肝炎，肾脏等多器官炎症。值得注意的是，半人源化抗体L3D10以及其完全人源化后的突变体抗体HL12和HL32在取得与Ipilimumab一样的甚至强于Ipilimumab的抗肿瘤效果的情况下，并没有产生严重的副作用【图4C】。同样，利用human CTLA-4全人源化（CTLA4h/h ）和半人源化（CTLA4h/m）的新生小鼠模型，研究者发现，再现Ipilimumab的免疫副作用需要CTLA4双等位基因的参与，因为在半人源化新生小鼠模型中， Ipilimumab并没有显示出强烈的副作用【图4D】。
此外，研究者还发现这种免疫治疗诱导的副作用，和全身的T细胞激活相关，特别是自我反应性T细胞中调节性T细胞（Treg）和效应T细胞（Teff）的比例起决定性的作用。这项研究表明，抗CTLA-4抗体的抗肿瘤效果和免疫治疗副作用的产生并不一定是相伴相随的，因为它们的分子机制是不一样的（一个依赖于肿瘤局部Treg的删除，一个依赖于自体反应性T细胞的扩增和全身T细胞的激活， 【图5】）。
图5. 抗CTLA-4抗体在免疫治疗诱导的副作用（irAE，immunotherapy related adverse events ）和 癌症免疫治疗效果（CITE，cancer immunotherapeutic effect）中有着截然不同的分子机制。 irAE是外周淋巴器官中自体反应性T细胞的多克隆扩增造成的，主要是通过抑制自身反应性T细胞转化成自身反应性Treg细胞。 CITE引起的肿瘤排斥是通过FcR介导的特异性清除肿瘤微环境中的Treg细胞来实现的，并且此过程独立于外周淋巴器官中天然T细胞的活化。此外，irAE和CITE都不依赖于对CTLA-4/B7相互作用的阻断。（摘自Cell Research (2018)doi:10.1038/s41422-018-0012-z）
刘阳/郑盼教授联合实验室的一系列突破性研究成果，进一步阐明了抗CTLA-4抗体的抗肿瘤分子机制，提供了有效的评价抗CTLA-4抗体药物安全性的小鼠模型，并初步筛选到相对于Ipilimumab更加安全的抗CTLA-4抗体克隆株HL12和HL32，这些研究对今后第3代抗CTLA-4抗体以及以CTLA-4为靶点的其它类型药物的研发有着重要的指导意义。
据悉，本研究完成于美国国立儿童医学中心的癌症与免疫学研究中心。杜雪相博士、唐飞博士和刘明月博士为两篇论文的共同第一作者，刘阳教授和郑盼教授为共同通讯作者。
参考文献：
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Hellmann, M. D., et al. Nivolumab plus Ipilimumab as first-line treatment for advanced non-small-cell lung cancer (CheckMate 012): results of an open-label, phase 1, multicohort study. Lancet Oncol. 18, 31–41 (2017).
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